2 × Pfu PCR Mix

A-1 Schabloun

■ D'Schabloun enthält Proteinverunreinigungen oder Taq Inhibitoren, asw .——Purifizéiert d'DNA Schabloun, läscht Protein Gëftstoffer oder extrahéiert Schabloun DNA mat Reinigungskits.

■ D'Denaturéierung vun der Schabloun ass net komplett ——Appropriately Erhéijung Denaturatiounstemperatur a verlängeren Denaturatiounszäit.

■ Degradatioun vun der Schabloun —— Virbereet d'Schabloun nei.

A-2 Primer

■ Schlechter Qualitéit vu Primer ——Synthetiséiert de Primer.

■ Primer Degradatioun ——Aliquot déi héich Konzentratioun Primer a klenge Volumen fir Erhaalung. Vermeit multiple Gefrierung an Ofdreiwung oder laangfristeg 4 ° C Kryopreservéiert.

■ Onkorrekt Design vu Primer (zB Primerlängt net genuch, Dimer geformt tëscht Primer, etc.) -Resign Primer (vermeit d'Bildung vu Primer Dimer a Sekundärstruktur)

A-3 mg Eng²⁺Konzentratioun

■ Mg²⁺ Konzentratioun ass ze niddereg ——Properly Erhéijung Mg²⁺ Konzentratioun: Optimiséiert de Mg²⁺ Konzentratioun duerch eng Serie vu Reaktiounen vun 1 mm bis 3 mm mat engem Intervall vun 0,5 mm fir den optimale Mg ze bestëmmen²⁺ Konzentratioun fir all Schabloun a Primer.

A-4 Annealing Temperatur

■ Déi héich Glühungstemperatur beaflosst d'Bindung vum Primer a Schabloun. ——Reduzéiert d'Anneidungstemperatur an optiméiert den Zoustand mat engem Gradient vun 2 ° C.

A-5 Verlängerung Zäit

■ Kuerz Verlängerungszäit —— Vergréissert Verlängerungszäit.

Phänomener: Negativ Proben weisen och d'Zilsequenzbands.

A-1 Kontaminatioun vum PCR

■ Kräizkontaminatioun vun der Zilsequenz oder Verstäerkungsprodukter ——Virsiichteg net d'Probe mat der Zilsequenz an den negativen Probe ze pipetten oder se aus dem Zentrifugrohr erauszespillen. D'Reagenz oder d'Ausrüstung solle autoklave ginn fir existent Nukleinsäuren ze eliminéieren, an d'Existenz vu Kontaminatioun sollt duerch negativ Kontrollexperimenter bestëmmt ginn.

■ Reagens Kontaminatioun ——Aliquot d'Reagenz a späichere bei niddregen Temperaturen.

A-2 Premierr

■ Mg²⁺ Konzentratioun ass ze niddereg ——Properly Erhéijung Mg²⁺ Konzentratioun: Optimiséiert de Mg²⁺ Konzentratioun duerch eng Serie vu Reaktiounen vun 1 mm bis 3 mm mat engem Intervall vun 0,5 mm fir den optimale Mg ze bestëmmen²⁺ Konzentratioun fir all Schabloun a Primer.

■ Falsch Primer Design, an d'Zilsequenz huet Homologie mat der Net-Zil Sequenz. ——Re-Design Primer.

Phänomener: D'PCR Verstäerkungsbänner sinn inkonsistent mat der erwaarter Gréisst, entweder grouss oder kleng, oder heiansdo komme béid spezifesch Verstäerkungsbänner an net spezifesch Verstäerkungsbänner op.

A-1 Primer

■ Schlecht Primer Spezifizitéit

——Re-Design Primer.

■ D'Primer Konzentratioun ass ze héich ——Erhéijung vun der Denaturatiounstemperatur korrekt an d'Denaturatiounszäit verlängeren.

A-2 Eng²⁺ Konzentratioun

■ Den Mg²⁺ d'Konzentratioun ass ze héich ——Reduktioun vun der Mg2+ Konzentratioun richteg: Optimiséieren vum Mg²⁺ Konzentratioun duerch eng Serie vu Reaktiounen vun 1 mm bis 3 mm mat engem Intervall vun 0,5 mm fir den optimale Mg ze bestëmmen²⁺ Konzentratioun fir all Schabloun a Primer.

A-3 Thermostabil Polymerase

■ Iwwerdriwwe Enzymbetrag ——Reduzéieren Enzymmengen entspriechend mat Intervallen vun 0,5 U.

A-4 Annealing Temperatur

■ D'Annealingtemperatur ass ze niddereg ——Appropriately erhéicht d'Annehlungstemperatur oder adoptéiert déi Zwee-Stuf Annealmethod

A-5 PCR Zyklen

■ Ze vill PCR Zyklen ——Reduzéieren d'Zuel vun de PCR Zyklen.

A-1 Primer——Schlecht Spezifizitéit ——Re-design de Primer, ännert d'Positioun an d'Längt vum Primer fir seng Spezifizitéit ze verbesseren; oder genéiert PCR ausféieren.

A-2 Schabloun DNA

——D’Schabloun ass net reng —— Purifizéiert d'Schabloun oder extrahéiert DNA mat Reinigungskits.

A-3 mg Eng²⁺ Konzentratioun

——Mg²⁺ d'Konzentratioun ass ze héich - - Mg korrekt reduzéieren²⁺ Konzentratioun: Optimiséiert de Mg²⁺ Konzentratioun duerch eng Serie vu Reaktiounen vun 1 mm bis 3 mm mat engem Intervall vun 0,5 mm fir den optimale Mg ze bestëmmen²⁺ Konzentratioun fir all Schabloun a Primer.

A-4 dNTP

—— D'Konzentratioun vun dNTPs sinn ze héich ——Reduzéieren d'Konzentratioun vun dNTP entspriechend

A-5 Annealing Temperatur

——Zevill niddereg Glühwärmtemperatur —— Passend d'Erhéijungstemperatur erhéijen

A-6 Zyklen

——Zevill Zyklen ——Optiméiert d'Zyklusnummer

Den éischte Schrëtt ass déi entspriechend Polymerase ze wielen. Regelméisseg Taq Polymerase kann net Korrektur liesen wéinst Mangel u 3'-5 'Exonuclease Aktivitéit, a Mëssverständnis wäert d'Extensiounseffizienz vu Fragmenter staark reduzéieren. Dofir kann reegelméisseg Taq Polymerase net effektiv Zilfragmenter méi grouss wéi 5 kb amplifizéieren. Taq Polymerase mat spezieller Modifikatioun oder aner High Fidelity Polymerase sollt ausgewielt ginn fir d'Extensiounseffizienz ze verbesseren an d'Bedierfnesser vun der laanger Fragmentamplifikatioun gerecht ze ginn. Zousätzlech erfuerdert d'Amplifikatioun vu laange Fragmenter och eng entspriechend Upassung vum Primer Design, Denaturatiounszäit, Verlängerungszäit, Puffer pH, etc. Normalerweis kënnen Primer mat 18-24 bp zu bessere Rendement féieren. Fir Schabloun Schued ze vermeiden, soll d'Denaturatiounszäit bei 94 ° C op 30 Sekonnen oder manner pro Zyklus reduzéiert ginn, an d'Zäit fir d'Temperatur op 94 ° C eropzesetzen ier d'Verstäerkung sollt manner wéi 1 min sinn. Ausserdeem kann d'Verlängerungstemperatur op ongeféier 68 ° C astellen an d'Verlängerung Zäit no dem Taux vun 1 kb/min designen eng effektiv Verstäerkung vu laange Fragmenter garantéieren.

De Feelerquote vun der PCR Verstäerkung ka reduzéiert ginn andeems verschidde DNA Polymerasen mat héijer Fidelitéit benotzt ginn. Ënnert all den Taq DNA Polymerasen, déi bis elo fonnt goufen, huet Pfu Enzym déi niddregst Feelerquote an déi héchste Vertrauen (kuckt ugeschloss Tabelle). Zousätzlech zu der Enzymauswiel kënnen d'Fuerscher de PCR Mutatiounsquote weider reduzéieren andeems d'Reaktiounsbedéngungen optimiséiert ginn, abegraff d'Optimiséierung vun der Puffersammlung, d'Konzentratioun vun der thermostabiler Polymerase an d'Optimiséierung vum PCR Zyklusnummer.