FastKing One Step RT-PCR Kit

A-1 RNA gëtt degradéiert

——Puriféieren héichqualitativ RNA ouni Kontaminatioun. D'Material aus deem d'RNA extrahéiert soll sou frësch wéi méiglech sinn fir RNA Degradatioun ze vermeiden. Analyséiert RNA Integritéit op denaturéierte Gel virun RT Reaktioun. Nom RNA Extraktioun sollt et an 100% Formamid gelagert ginn. Wann RNase Inhibitor benotzt gëtt, soll d'Heizungstemperatur <45 ° C sinn, an de pH sollt manner wéi 8,0 sinn, soss wäert den Inhibitor all gebonnen RNase fräisetzen. Ausserdeem sollt de RNase Inhibitor a Léisungen derbäigesat ginn, déi ≥ 0,8 mM DTT enthalen.

A-2 RNA enthält Inhibitoren vu Reverse Transkriptiounsreaktiounen

——Reverse Transkriptiounsinhibitoren enthalen SDS, EDTA, Glycerol, Natriumpyrophosphat, Spermidin, Formamid, Guanidinsalz, asw. Wäscht RNA Nidderschlag mat 70% (v/v) Ethanol fir Inhibitoren ze läschen.

A-3 Net genuch Glühung vu Primer benotzt fir d'Synthese vun der éischter Streng vun cDNA

- Bestëmmt datt d'Annealingstemperatur gëeegent ass fir d'Primeren, déi am Experiment benotzt goufen. Fir zoufälleg Hexamer ass et recommandéiert d'Temperatur op 25 ° C fir 10 Minutten ze halen ier d'Reaktiounstemperatur erreecht gëtt. Fir genspezifesch Primer (GSP), probéiert aner GSP, oder wiesselt op Oligo (dT) oder zoufälleg Hexamer.

A-4 Kleng Betrag u Start-RNA

——Erhéicht d'Quantitéit u RNA. Fir RNA Proben manner wéi 50 ng, 0.1 μg bis 0.5 μg Acetyl BSA kënnen an der éischter Streng cDNA Synthese benotzt ginn

A-5 D'Zilsequenz gëtt net an den analyséierten Tissue ausgedréckt.

- Probéiert aner Gewëss.

A-6 PCR Reaktioun feelt

—— Fir zwee-Schrëtt RT-PCR kann d'CDNA Schabloun am PCR Schrëtt net 1/5 vum Reaktiounsvolumen iwwerschreiden.

A-1 Net-spezifesch Glühung vu Primer a Schablounen

——Den 3'-Enn vu Primer däerf net 2-3 dG oder dC enthalen. Benotzt Gene-spezifesch Primer an der éischter Streng Synthese anstatt zoufälleg Primer oder Oligo (dT). Benotzt eng méi héich Glühungstemperatur an den éischte puer Zyklen, an dann eng méi niddereg Glühungstemperatur. Benotzt Hot-Start Taq DNA Polymerase fir PCR fir d'Spezifitéit vun der Reaktioun ze verbesseren.

A-2 Schlecht Design vu genspezifesche Primer

--— Follegt déiselwecht Prinzipien fir Verstäerkung Primer Design.

A-3 RNA kontaminéiert mat genomesch DNA

——Treat RNA mat PCR-Grad DNase I. Setzt eng Kontrollreaktioun op ouni Reverse Transkriptioun fir DNA Kontaminatioun z'entdecken.

A-4 Forming vum Primer Dimer

—— Design Primer ouni komplementär Sequenzen um 3 'Enn.

A-5 Ze héich Mg²⁺ Konzentratioun

—— Optimaliséiert Mg²⁺ Konzentratioun fir all Schabloun a Primer Kombinatioun

A-6 Kontaminéiert mat auslänneschen DNA

—— Benotzt aerosolresistente Tipps an UDG Enzyme.

A-1 Den Inhalt vum éischte Strangprodukt ass ze héich

- reduzéieren d'Quantitéit vum éischte Strangprodukt am konventionelle PCR Reaktiounsstuf.

A-2 Ze héich Primer Betrag an der PCR Reaktioun

——Reduce primer input.

A-3 Ze vill Zyklen

——Optimize PCR Reaktiounsbedéngungen a reduzéiert PCR Zykluszuel.

A-4 Ze niddereg Glühwärmtemperatur

——Erhéijung Annealing Temperatur fir net spezifesch Initiatioun an Extensioun ze vermeiden.

A-5 Net-spezifesch Verstäerkung vun Oligonukleotidfragmenter generéiert duerch DNase Degradatioun vun DNA ——Extract héichqualitativ RNA fir DNA Kontaminatioun ze vermeiden.

RT-PCR ass Transkribéiere RNA an cDNA ëmgedréint, an dann d'Reverse transkribéiert cDNA als Schabloun fir PCR Reaktioun ze benotzen fir d'Zilfragment ze verstäerken. Wielt entweder zoufälleg Primer, Oligo dT a gen spezifesch Primer no de spezifesche Bedéngungen vum Experiment. All déi uewe genannte Primer kënne benotzt gi fir kuerz eukaryotesch Zell mRNA ouni Haarspinnestruktur.

Zoufälleg Primer: Gëeegent fir laang RNA mat Hoernolstruktur, souwéi all Zorte vu RNA wéi rRNA, mRNA, tRNA, etc. Si gi haaptsächlech fir RT-PCR Reaktioun vun enger eenzeger Schabloun benotzt.

Oligo dT: Gëeegent fir RNA mat PolyA Tailing (prokaryotesch RNA, eukaryotesch Oligo dT rRNA an tRNA hu keng PolyA Schwänz). Well den Oligo dT un de PolyA Schwanz gebonnen ass, ass d'Qualitéit vu RNA Proben erfuerderlech héich ze sinn, a souguer e klengen Ofbau wäert de Betrag vun der voller Längt cDNA Synthese staark reduzéieren.

Genspezifesch Primer: Komplementär zu der Schablounsequenz, gëeegent fir Situatiounen wou d'Zilsekvens bekannt ass.

Et ginn zwou Weeër:

1. Intern Referenzmethod: An der Theorie ass cDNA DNA Fragmenter vu verschiddene Längt, sou datt d'Resultat vun der Elektrophorese verschmiert ass. Wann d'RNA Heefegkeet niddereg ass, weist kee Produkt an der Elektrophorese, awer dëst heescht net datt kee Produkt vum PCR verstäerkt gëtt. Am Allgemengen kann intern Referenz benotzt ginn fir cDNA z'entdecken. Wann déi intern Referenz Resultater huet, kann d'Qualitéit vun cDNA am Fong garantéiert sinn (an e puer Fäll, wann d'Zilgenfragment ze laang ass, kënnen et Ausnahmen ginn).

2. Wann et e bekannte Gen gëtt verstäerkt vun dëser Schabloun, kann et vun de Primer vun dësem Gen verifizéiert ginn. D'Amplifikatioun vun der interner Referenz heescht net onbedéngt datt et kee Problem mat cDNA gëtt. Well intern Referenz héich Iwwerfloss an cDNA huet, ass et einfach ze verstäerken. Wann cDNA aus verschiddene Grënn deelweis degradéiert ass, aus der Perspektiv vun der Wahrscheinlechkeet, ginn PCR Resultater vun nidderegen Iwwerfloss Zilgenen staark beaflosst. Wärend intern Referenz nach ëmmer héich ass am Iwwerfloss, wäert d'Verstäerkung wahrscheinlech net beaflosst ginn.

Degradéiert deelweis vum RNA. Detektéiert d'Integritéit a purifizéiert vu RNA

D'RNA Inhalter vu verschiddenen Arten kënnen anescht sinn, awer am Allgemengen soll d'extraktéiert total RNA zwou kloer 28S an 18S Banden an der Gelelektroforese enthalen, an d'Hellegkeet vun der fréierer Band sollt duebel sou héich sinn wéi déi vun der Lescht. D'5S Band weist datt d'RNA degradéiert ass, a seng Hellegkeet ass proportional zum Grad vun der Degradatioun. Déi erfollegräich Verstäerkung vun der interner Referenz heescht net datt et kee Problem mat RNA gëtt, well d'intern Referenz an héijer Iwwerfloss ass, kann d'RNA verstäerkt ginn soulaang d'Degradatioun net schwéier ass. Den OD₂₆₀/OD₂₈₀Verhältnis vu reinen RNA gemooss mam Spektrofotometer sollt tëscht 1.9 an 2.1 sinn. Eng kleng Quantitéit u Protein Onreinheet an der RNA wäert d'Verhältnis reduzéieren. Soulaang de Wäert net ze niddreg ass, gëtt RT net beaflosst. Wat am wichtegsten fir RT wichteg ass RNA Integritéit.

D'Verlängerung vum internen Referenzgen kann nëmmen uginn datt RT gelongen ass, awer et ass net onbedéngt mat der Qualitéit vum cDNA Strang verbonnen. Well déi intern Referenzfragmenter allgemeng kleng a Gréisst an héich am Ausdrock sinn, si si méi einfach fir ëmgedréint Transkriptioun erfollegräich ze sinn. Wéi och ëmmer, d'Gréisst an den Ausdrock vum Zilgen variéiert vu Gen zu Gen. D'CDNA Qualitéit kann net nëmmen duerch intern Referenz beurteelt gi besonnesch fir d'Zilfragmenter méi laang wéi 2 kb.

E puer Proben hunn komplex sekundär Strukturen, oder hunn e räiche GC Inhalt, oder si wäertvoll mat nidderegen Iwwerfloss. An dëse Fäll sollt passend Reverse Transkriptase no der Gréisst vum Zilfragment an der Probe ausgewielt ginn. Fir RNA Skeletter mat héije GC Inhalt a komplexer sekundärer Struktur ass et schwéier déi sekundär Struktur bei niddregen Temperatur opzemaachen, oder mat gemeinsame Reverse Transkriptase. Fir dës Schabloune kann Quant Reverse Transkriptase ausgewielt ginn, well seng Reverse Transkriptiounsleeschtung offensichtlech besser ass wéi déi vun der M-MLV Serie Reverse Transkriptase, déi verschidde RNA Template effizient ëmkreest an RNA an d'CDNA éischt Streng am maximalen Ausmooss transkribéiere kann. Wann Dir allgemeng Reverse Transkriptasekit benotzt, kann 20 μl System nëmmen effektiv 1 μg total RNA transkriberéieren. Opgepasst w.e.g. op déi maximal RT Kapazitéit vum Kit. Wann d'Schabloun iwwerschësseg bäigefüügt gëtt, ëmgedréint Transkriptioun favoriséiert d'RNA mat héijer Iwwerfloss. Dofir ass et besser net déi maximal Kapazitéit vum System ze iwwerschreiden.

A-1 Bestëmmt ob RNA schwéier degradéiert ass a wann RT erfollegräich ass

Am Allgemengen ass de Grond fir den Echec vun der interner Referenzamplifikatioun dacks duerch eescht RNA Degradatioun verursaacht. En anere méigleche Grond ass Reverse Transkriptiounsfehler. Intern Referenz kann net als Standard benotzt ginn fir d'Qualitéit vum cDNA eenzege Strang ze beurteelen, awer et kann als Standard benotzt ginn fir ze beuerteelen ob Reverse Transkriptioun erfollegräich ass wann et kee Problem vun der RNA Qualitéit ass. Déi Wichtegst am Reverse Transkriptiounsprozess ass eng konstant Temperatur an e konstante Reaktiounssystem z'erhalen fir d'Reaktiounseffizienz ze verbesseren.

A-2 Bestëmmt ob d'Primeren fir d'Verstäerkung vun interne Referenzgenen zouverlässeg sinn a wann et Probleemer mat Reagenz am PCR benotzt gëtt.

Fir relativ Quantifizéierung muss RNA virun der Reverse Transkriptioun quantifizéiert ginn, wat och a ville Reverse Transkriptiouns Kits erfuerderlech ass, zum Beispill, quantifizéieren d'RNA Input als 1 μg. Well de ëmgedréit transkribéierten cDNA eng gemëschte Léisung ass, inklusiv RNA, Oligo dT, Enzym, dNTP, a souguer e klengen DNA Rescht, gëtt Ofwäichung verursaacht, sou datt et onméiglech ass d'CDNA genee ze quantifizéieren. Dofir ass RNA Quantifizéierung noutwendeg. Bedenkt d'Reverse Transkriptiounseffizienz d'selwecht bei verschiddene Proben, de Betrag u cDNA kritt sollt d'selwecht sinn, an déi quantitativ Analyse kann de Verglach vun Ausdrockniveau vu verschiddene Genen an der selwechter Quantitéit vum Gesamt RNA weisen. Wann Dir relativ Fluoreszenz quantitativ PCR ausféiert, kann quantitativ cDNA net no ëmgedréint Transkriptioun erfuerdert ginn, well dat intern Referenzgen als Referenz gehandelt ka ginn.

Et ass haaptsächlech mat de Genen verbonnen, an ëmgedréint Transkriptioun vum laange Fragment ass net machbar fir déi meescht Genen. Als éischt ass d'Effizienz vun der Reverse Transkriptioun vill méi niddereg wéi déi vum PCR. Zweetens, d'GC räich Regioun a sekundär Struktur vu ville Genen beschränken souwuel ëmgedréint Transkriptioun wéi och Hinnen alleguer. Endlech ass d'Fidelitéit an d'Verstäerkungseffizienz vum PCR schwéier gläichzäiteg ze garantéieren. Am Prozess vun der Reverse Transkriptioun ka kee garantéieren e laange Fragment fir niddereg Kopie Genen ze kréien, besonnesch mat Oligo dT. Wéi fir 5 'UTR mat méi GC, ass et nach méi schwéier. Dofir ass et ëmmer nach eng raisonnabel Method fir Transkript mat zoufällege Primer ëmzegoen, déi natierlech Spaltplazen am Zilfragment ze fannen, duerch Segmenter ze verstäerken an dann d'Restriktiouns Verdauung an d'Ligatioun auszeféieren. Am Allgemengen ass et schwéier Fragmenter méi grouss wéi 2 kb direkt ze verstäerken, awer et ass net ëmmer onméiglech ze kréien: 1. Éischtens, garantéiert d'Integritéit vu RNA/mRNA, an TRIZOL Extraktioun gëtt bevorzugt. 2.M-MLV RT-PCR Kit kann direkt benotzt ginn. Verlängert Glühzäit an erhéicht d'Zykluszuel am Verstärkungsprozess richteg. Alternativ kann nestéiert PCR ugewannt ginn, oder eng oder zwou Reaktiounen ausféieren als éischt mat passend verlängerten Denaturatioun an Verlängerung Zäit ier normal PCR Verstäerkung, wat hëllefe kann fir Fragmenter ze verlängeren. Opgepasst op d'Fidelitéit vun der Polymerase. 3. Long Taq kann am PCR benotzt ginn fir ideal Resultater ze kréien. 4. Fir Protein Ausdrock Uwendung, High Fidelity Polymerase soll ugewannt ginn.

Et ginn zwou Aarte vu Reverse Transkriptase ugebuede vum TIANGEN: Quant/King RTase an TIANScript M-MLV. Den Haaptunterschied tëscht hinnen ass den Input Betrag u Templates. Quant ass eng eenzegaarteg Reverse Transkriptase, déi anescht ass wéi déi allgemeng benotzt M-MLV ofgeleet vum Moloney murine Leukämie Virus. Quant ass eng nei héicheffizient Reverse Transkriptase rekombinant ausgedréckt vum Ingenieur Escherichia coli. Quant ass gëeegent fir 50 ng-2 μg RNA mat héijer ëmgekéiert Transkriptiounsaktivitéit an héijer Ausbezuelung ze verstäerken. Am Verglach mat gewéinleche MMLV oder AMV ass dem Quant seng gréisste Charakteristik datt et eng ganz staark Affinitéit mat RNA Templates huet a kann Transkript komplex Templates ouni Héich Temperatur Denaturatioun ëmgedréint hunn. Fir Schabloune mat méi héije GC Inhalt ass d'Reverseffizienz méi héich. Wéi och ëmmer, dës Reverse Transkriptase huet RNase H Aktivitéit, wat d'Längt vum cDNA Produkt beaflosse kann (passend fir <4.5 kb Schablounen). Fir konventionell Reverse Transkriptioun gëtt TIANScript MMLV Reverse Transkriptase empfohlen. Dës RTase ass e modifizéiert Enzym mat ganz schwaacher RNase H Aktivitéit, déi gëeegent ass fir laang (> 5 kb) cDNA Synthese.

Een-Schrëtt ëmgedréint Transkriptioun a PCR Verstäerkung ginn am selwechte Rouer ofgeschloss ouni den Tube Cover tëscht cDNA Synthese an Amplifikatioun opzemaachen, wat hëllefräich ass fir d'Kontaminatioun ze reduzéieren. Well all kritt cDNA Proben fir d'Verstäerkung benotzt ginn, ass d'Sensibilitéit méi héich, mat engem Minimum vun 0.01 pg vun der totaler RNA. Fir erfollegräiche One-Step RTPCR, gi gen-spezifesch Primer allgemeng benotzt fir d'CDNA Synthese unzefänken. Déi Zwee-Schrëtt Method, nämlech Reverse Transkriptioun a PCR Verstäerkung gëtt an zwee Schrëtt duerchgefouert. Als éischt gëtt ëmgedréit Transkriptioun aus enger RNA Schabloun ausgefouert fir cDNA ze kréien, an déi kritt cDNA gëtt un eng oder méi verschidde PCR Reaktiounen ënnerworf. Déi Zwee-Schrëtt Method kann Oligo (dT) oder zoufälleg Primer benotzen fir d'Synthese vum éischte Streng vun cDNA ze guidéieren, a kann all mRNA Informatioun vun enger spezifescher Probe transkribéieren.